修飾ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびその使用

专利摘要:
本発明は、改良ＲＮＡｉコンストラクトおよびその使用に関する。コンストラクトは、１９〜４９ヌクレオチド、好ましくは２５、２６、または２７ヌクレオチド、の二本鎖領域および好ましくは平滑末端を有する。コンストラクトは、生物学的活性、毒性、安定性、および標的遺伝子特異性の至適バランスをもたらすために、選択的な最小限の修飾を有する。例えば、コンストラクトがダイサーまたは他のＲＮＡｓｅＩＩＩによって切断されないように、およびアンチセンス鎖の全長がＲＩＳＣへと組み込まれるように、センス鎖を修飾し得る（例としては、センス鎖の一または両末端を４つの２’−Ｏ−メチル基によって修飾する）。加えて、アンチセンス鎖をまた、オフターゲットなサイレンシングを大幅に低減させるために、５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−メチル基によって修飾し得る。本発明のコンストラクトは、哺乳類細胞中のインターフェロン応答および配列非依存性アポトーシスを大幅に回避し、より良い血清安定性および増強された標的特異性を示す。
公开号:JP2011511636A
申请号:JP2010545897
申请日:2009-02-11
公开日:2011-04-14
发明作者:ウルフ，トッド，エム．；カーメンズ，ジョアンヌ；クヴォロヴァ，アナスターシア；サロモン，ウィリアム；パブコ，パメラ，エー．
申请人:アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション；
IPC主号:C12N15-113

专利说明:

[0001] 背景技術
相補的なオリゴヌクレオチド配列は、有望な治療剤であり、遺伝子の機能を解明するのに有用な研究ツールである。しかしながら、従来技術のオリゴヌクレオチド分子は、それらの臨床開発を妨げ得、かかる組成物を用いた遺伝子発現（タンパク質合成を含む）の意図された効果的な阻害の達成を頻繁に難しくさせる幾つかの問題に悩まされる。]
[0002] 例えば、古典的なｓｉＲＮＡは、それらの剤がヒトの治療剤として中程度な有用性しかもたらし得ない制限および欠点を有する。具体的には、古典的なｓｉＲＮＡは二本鎖である。各分子について、二本の鎖が合成されて対にされる必要がある。古典的なｓｉＲＮＡは天然に存在するリボヌクレオチドから作製され、ヌクレアーゼおよび自発的な加水分解に脆弱である。古典的なｓｉＲＮＡ鎖は、一つの鎖の各末端におけるオーバーハングを除き、互いに対となり、およそ１９から２３ヌクレオチド長である。この構成は、化合物の多様性および活性を制限する。例えば、より長いオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡへのより高い結合活性を有し得、これはしばしばより高い活性と相関する。古典的なｓｉＲＮＡのオーバーハングは不安定さ（なぜならば一本鎖は、大抵の場合、二本鎖よりもヌクレアーゼ抵抗性であるからである）および分解の原因となり、分子が互いにまたは他のヌクレオチドに「付着する」原因となり得る。]
[0003] 加えて、２１ｍｅｒより長い二本鎖ＲＮＡは、哺乳類細胞中のダイサーまたはダイサー様ＲＮＡｓｅＩＩＩによって切断され、その結果古典的なｓｉＲＮＡ産物となると広く信じられている。ダイサー切断産物の一本鎖は次にＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、そして取り込まれたＲＩＳＣ複合体はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）をもたらすように導かれる。しかしながら、ダイサーは配列特異的ではないため、非修飾の長いｄｓＲＮＡのダイサー切断産物は、２１ｍｅｒの不均質な混合物であり、各々が異なる生物学的活性および／または薬理学的性質を有し得る。加えて、各２１ｍｅｒは明確なオフターゲット効果（例として、ダイサー切断産物と標的ｍＲＮＡ間での擬似的な配列相同性に例えば起因して、意図されない標的の機能を阻害すること）を有し得る。言い換えると、活性剤（例として、２１ｍｅｒ）は、比較的予測不可能な標的特異性、生物学的活性および／または薬理学的性質を有する複数の種になり得る。また、ダイサー産物は親鎖よりも短く、低親和性のガイド鎖となる。]
[0004] その他の問題として含まれるものは、生物システムへ適用されたときの、非特異的なヌクレアーゼ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性である。したがって、上記の問題点のないまたは程度が軽減された改良オリゴヌクレオチドを設計することで従来技術のオリゴヌクレオチドを改良することは、非常に有益であろう。]
[0005] 本発明の１つの側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、を含み、ここで（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトに関する。]
[0006] 本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の３’−末端において、（ｉ）非加水分解性のヌクレオチド間結合を有する少なくとも４つの連続した２’−修飾リボース糖（ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の２’−修飾リボース糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖、または（ｉｉｉ）保護基を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0007] 本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有し、該センス鎖が、該センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含む、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0008] 本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれに４つの連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが存在し、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｂ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0009] 本発明の別の側面は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、１２および１０の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドをそれぞれ５’−末端および３’−末端に含む、および、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）非修飾である、（ｂ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｃ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0010] ある態様において、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位における、標的遺伝子のｍＲＮＡの一様な切断を導く。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、該センス鎖の３’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断可能である。
ある態様において、ｄｓＲＮＡコンストラクトが、平滑末端である。]
[0011] ある態様において、センス鎖の５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドが２’−修飾リボース糖である。
ある態様において、センス鎖の各末端が、一続き(continuous stretch)の２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、センス鎖の各末端が、４つ一続きの２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、アンチセンス鎖が、非連続的な２’−修飾リボース糖を含み、１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない。
ある態様において、アンチセンス鎖が、２’−修飾リボース糖を、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドごとに含む。]
[0012] ある態様において、アンチセンス鎖の最も５’−末端側の２’−修飾リボース糖が、２番目のヌクレオチドである。
ある態様において、ｄｓＲＮＡコンストラクトが、１２〜３５ヌクレオチドの長さ、２５〜３０ヌクレオチドの長さ、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドより長い長さ、２５ヌクレオチドより長い長さ、または３１〜４９ヌクレオチドの長さである。
ある態様において、センス鎖の各末端が、独立して、４〜１６個の２’−修飾リボース糖および／または非加水分解性ヌクレオチド間結合を含む。]
[0013] ある態様において、センス鎖の各末端が、対称的なまたは非対称的な数の２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、２’−修飾リボース糖が、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ−（デオキシリボヌクレオチド）またはそれらの組み合わせである。
ある態様において、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。
ある態様において、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−アリルヌクレオチドである。]
[0014] ある態様において、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、２’−修飾を前記の位置に含まない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する。
ある態様において、アンチセンス鎖が、ホスホチオエート結合を有する少なくとも４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、ミスマッチヌクレオチドを含む。]
[0015] ある態様において、ｄｓＲＮＡが、同一の配列を有する非修飾のｄｓＲＮＡと比較して、血清および／または脳脊髄液中での改善された安定性を有する。
ある態様において、センス鎖の３’−末端における最後から２〜８番目のヌクレオチドが、それらの対応するアンチセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチである。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、初代細胞（primary cells）においてインターフェロン応答を誘導しない。
ある態様において、センス鎖のいずれかの末端および／またはアンチセンス鎖の３’−末端が、保護基によってブロックされている。]
[0016] ある態様において、保護基が、反転ヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドである。
ある態様において、反転ヌクレオチドが、反転デオキシヌクレオチドを含む。
ある態様において、反転脱塩基部分が、反転デオキシ脱塩基部分を含む。
ある態様において、反転デオキシ脱塩基部分が、３’，３’−連結または５’，５’−連結デオキシ脱塩基部分である。
ある態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の交互(alternating)ヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を含み、各２’−修飾リボース糖が、逆鎖上の非修飾ヌクレオチドと向き合う。]
[0017] ある態様において、最初の２’−修飾アンチセンスヌクレオチドが、最も５’−末端のアンチセンスヌクレオチドであるか、またはアンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドである。
ある態様において、標的遺伝子が、ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、ＲＩＰ１４０、ＰＣＳＫ９、ＴＮＦα、ＡＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質）またはＭＡＰ４Ｋ４である。
ある態様において、２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、２’−Ｆ修飾である。
ある態様において、２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、プリンヌクレオチドであり、任意に２’−Ｆ修飾修飾および／またはホスホロチオエート結合を有する。]
[0018] ある態様において、２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、１または２以上の、各１〜５ヌクレオチドのバルジを形成する。
ある態様において、各一続きの２’−修飾リボース糖が、末端ヌクレオチド、末端ヌクレオチドから二番目のヌクレオチド、または末端ヌクレオチドから三番目のヌクレオチドから独立して開始される。
ある態様において、アンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドの５０〜１００％が、独立して２’−Ｆ修飾または２’−Ｏ−メチル修飾である。
ある態様において、アンチセンス鎖の５’−末端が、リン酸化されている。]
[0019] 関連する側面において、本発明はまた、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡコンストラクトであって、該コンストラクトが、センス鎖上の単一ニック以外は主題のｄｓＲＮＡと同一である、前記ＲＮＡコンストラクトを提供する。例えば、ニックは、アンチセンス鎖の５’末端から約１０塩基のヌクレオチドの逆位置を占めてよい。ニックはまた、アンチセンス鎖の５’末端から約５〜１５塩基のヌクレオチドの逆位置を占めてよい。ある態様において、各デュプレックス領域のΔＧが、約−１３ｋｃａｌ／モル未満である。]
[0020] 本発明の別の側面は、主題のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖（例として、非修飾のセンス鎖など）発現するベクターを提供する。
本発明の別の側面は、主題のベクターまたは主題のｄｓＲＮＡを含む細胞を提供する。
ある態様において、細胞が、培養哺乳類細胞である。
ある態様において、細胞が、ヒト細胞である。
本発明の別の側面は、主題のｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。]
[0021] 本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
ある態様において、哺乳類細胞が、培養されている。
ある態様において、哺乳類細胞が、ヒト細胞である。
ある態様において、哺乳類細胞を、送達試薬の存在下で接触させる。
ある態様において、送達試薬が、脂質である。
ある態様において、脂質が、カチオン性脂質である。
ある態様において、送達試薬が、リポソームである。]
[0022] 本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトの鎖の少なくとも１つを発現するベクターとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング効果を改善するための方法であって、ｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンスヌクレオチドを修飾して、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとすることを含む、前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、ｓｉＲＮＡコンストラクトの標的部位へのin vivo送達を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡコンストラクトとともにＰＰＩＢを標的とする主題のｄｓＲＮＡコンストラクトを共送達し、標的部位におけるＰＰＩＢ機能の阻害をアッセイすることを含み、ここでＰＰＩＢ機能の標的部位における阻害の成功が、標的部位へのｓｉＲＮＡコンストラクトのin vivo送達成功の指標となる、前記方法を提供する。]
[0023] 本発明の別の側面は、表中に開示されたものおよび／またはＳＯＤ１もしくは他の特定の標的遺伝子に対するものなど、本明細書に開示されたあらゆるｄｓＲＮＡに関する。
さらに、ここでおよび本明細書中のどこかで記載されたあらゆる態様は、適用可能な場合には他のあらゆる態様と組み合わせることができるものとする。]
図面の簡単な説明

[0024] 図１は、本発明のある修飾ＲＮＡｉコンストラクト（簡潔化のために、代替ＲＮＡｉ化合物と称す）を示す。] 図１
[0025] 図２は、Ｒ１のｓｉＲＮＡまたは代替ＲＮＡｉ化合物でトランスフェクションした２４時間後のＳＯＤ１発現を図示する。] 図２
[0026] 図３は、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルを低減させる活性のある代替ＲＮＡｉ化合物の配列を示す。] 図３
[0027] 図４は、選択した標的部位についてのある代表的な代替ＲＮＡｉ化合物（例として、平滑末端を有し、センス鎖の各末端上に４つの２’ＯＭｅを有する２５−ｍｅｒ）がマウスおよびヒトＳＯＤ１に対して有効であることを示す。] 図４
[0028] 図５Ａは、ＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析および５０ｐＭ未満のＥＣ５０値を有する活性デュプレックスの同定を図示する。] 図５Ａ
[0029] 図５Ｂは、ヒトＨＥＫ２９３細胞中のＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、および約５０ｐＭのＥＣ５０値を有する活性デュプレックスの同定を示す。] 図５Ｂ
[0030] 図５Ｃは、ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＳＯＤ１の代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、および約５０ｐＭのＥＣ５０値を有する活性デュプレックスの同定を示す。] 図５Ｃ
[0031] 図６Ａは、ｓｉＲＮＡまたは代替ＲＮＡｉ化合物でトランスフェクションした後の、ユビキタスタンパク質であるＰＰＩＢ（シクロフィリンＢ）の発現量を示す。] 図６Ａ
[0032] 図６Ｂは、ヒトＨＥＫ２９３細胞中のＰＰＩＢの代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、ならびに２５−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒのＥＣ５０値がそれぞれ約２５または約７２ｐＭである活性デュプレックスの同定を示す。] 図６Ｂ
[0033] 図６Ｃは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＰＰＩＢの代替ＲＮＡｉ化合物についての用量反応分析、ならびに２５−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒのＥＣ５０値がそれぞれ約２００または約５００ｐＭである活性デュプレックスの同定を示す。] 図６Ｃ
[0034] 図７は、センス鎖修飾を有する代替ＲＮＡｉ化合物の２５−ｍｅｒがダイサー酵素によって切断されないことを実証する。] 図７
[0035] 図８Ａは、２５−ｍｅｒのデュプレックスがＲＮＡｉサイレンシングＡｇｏ２複合体と会合することが見出されることを実証する。] 図８Ａ
[0036] 図８Ｂは、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスのガイド鎖についてのノーザンブロットを示す。図８Ｃは、ｃ−ｍｙｃ Ａｇｏ２を発現する２９３細胞のトランスフェクション後のＳＯＤ１発現量を示す。]
[0037] 図９Ａおよび９Ｂは、ダイサープロセシングされない２１ｎｔより長いデュプレックスのための、アンチセンス鎖の５’−末端から１０ｎｔにある一律(uniform)の切断箇所を示す。合成基質を、試験されたＲＮＡデュプレックスについての標的配列を含むＳＯＤ１遺伝子の５０ｎｔ領域に相当するように、化学的に合成した。図９Ａは、合成基質ならびに予想切断箇所および産物の概略図である。図９Ｂ中では、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスを、ｃ−ｍｙｃ Ａｇｏ２を発現する２９３細胞へと、方法欄に記載のようにトランスフェクトした。細胞を採取、溶解し、ｃ−ｍｙｃ Ａｇｏ２を免疫沈降し、緩衝液中で再構成した。免疫沈降物を５０ｎｔの３２−Ｐ−標識化合成基質とともに３０℃で２時間、方法欄に記載のように、インキュベートした。２時間のインキュベート後、サンプルをサイズマーカー（下線で表示される）と並べて変性ポリアクリルアミドゲルにロードした。サンプルのアルファベット表記は、パネルＡの概略に示される以下のデュプレックスに相当する。Ａ＝非修飾１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ、Ｂ＝非修飾２５−ｂｐデュプレックス、Ｃ＝４／４ ２’ＯＭｅを有する２５−ｂｐデュプレックス、Ｄ＝４／４ ２’ＯＭｅを有する２５−ｂｐデュプレックス、Ｅ＝ルシフェラーゼ対照デュプレックス。]
[0038] 図１０Ａは、広範な化学的修飾分析のために用いた二つの代表的な配列、ＩＤ番号１００１５および１００２３を示す。] 図１０Ａ
[0039] 図１０Ｂは、それぞれセンス鎖についての修飾化学構造ＩＤ（００１、００２、００３等）およびアンチセンス鎖についての修飾化学構造ＩＤ（０１１、０１２、０１３等）を列挙し、設計されたおよび／または試験された全ての２５−ｍｅｒについての各ヌクレオチド位置における修飾の詳細な概要をＩＤ毎に示している。] 図１０Ｂ
[0040] 図１１は、センス鎖およびアンチセンス鎖上の修飾タイプに依存するＳＯＤ１のｍＲＮＡレベル低減の変動度合いを図示する。] 図１１
[0041] 図１２Ａは、センス鎖のみにおける２’ＯＭｅ位置の変動の関数として、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。各デュプレックスはＩＤ番号１００１５または１００２３の配列に基づく。] 図１２Ａ
[0042] 図１２ＢおよびＣは、センス鎖のみにおける２’ＯＭｅ位置の変動の関数として、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。各デュプレックスはＩＤ番号１００１５または１００２３の配列に基づく。]
[0043] 図１３Ａは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。] 図１１Ｂ 図１３Ａ
[0044] 図１３Ｂは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。] 図１１Ｂ 図１３Ｂ
[0045] 図１３Ｃは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。] 図１１Ｂ 図１３Ｃ
[0046] 図１３Ｄは、示される多様なアンチセンス鎖化学構造（０１１、０１３、０４２等。図１１Ｂを参照のこと）との組合せにおいて、センス鎖における２’ＯＭｅ位置の変動に応じた、ＳＯＤ１発現の抑制についてのデュプレックスの相対活性を示す。] 図１１Ｂ 図１３Ｄ
[0047] 図１４Ａは、示されるような各デュプレックス上の修飾の結果としての、血清および／または脳脊髄液におけるデュプレックスの安定性の改善を実証する。] 図１４Ａ
[0048] 図１４Ｂは、示されるような各デュプレックス上の修飾の結果としての、血清および／または脳脊髄液におけるデュプレックスの安定性の改善を実証する。] 図１４Ｂ
[0049] 図１５Ａは、２１−ｂｐ以上のデュプレックスでのＲＮＡｉ活性にダイサーは必要とされないことを実証する。バーは、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイによって測定されたトランスフェクション４８時間後のＳＯＤ１のｍＲＮＡレベルを表す。３つのデュプレックスについてのＳＯＤ１のｍＲＮＡ低減データが示されている；１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ（白いバー）、非修飾（０／０）２５−ｂｐデュプレックス（黒いバー）、および「４／４」２’ＯＭｅ２５−ｂｐデュプレックス（縞のバー）。
図１５Ｂは、本研究で用いた配列を示す。] 図１５Ａ 図１５Ｂ
[0050] 図１６Ａは、図１５Ａの観察と類似して、２７ｂｐデュプレックスでのＲＮＡｉ活性にダイサーは必要とされないことを示す。バーは、ｂＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイによって測定した、トランスフェクション４８時間後のＰＰＩＢのｍＲＮＡレベルを表す。白いバーは１９−ｂｐ＋２ｎｔのｓｉＲＮＡ、点状のバーは非修飾２５−ｂｐデュプレックス、黒いバーは２’ＯＭｅ化学構造を有する２５−ｂｐデュプレックス、そして縞のバーは２’ＯＭｅ化学構造を有する２７−ｂｐデュプレックスである。
図１６Ｂは配列を示す。] 図１５Ａ 図１６Ａ 図１６Ｂ
[0051] 図１７ＡおよびＢは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が、ｓｉＲＮＡへの２１ｎｔより大きなＲＮＡデュプレックスのダイサー酵素プロセシングを、抑制および阻害することを示す。図１７Ａは、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡデュプレックスへ適用した化学的修飾の概略図である。デュプレックス中の「Ｒ」は、通常のまたは２’位置修飾を有しない非修飾のＲＮＡヌクレオチドを表す。「Ｍ」は、ＲＮＡのヌクレオチドの２’位置へのＯ−メチル修飾を表す。特に記さない限り、ほとんどのヌクレオチド修飾をパッセンジャー鎖に配置する。 図１７Ｂは、本明細書中に記載のように組換ヒトダイサー酵素とともに一晩インキュベーションした後の、ＲＮＡデュプレックスのＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルである。レーンＭは、サイズ（上から下）が２５−ｂｐ、２１−ｂｐ、１７−ｂｐであるｓｉＲＮＡマーカーを指す。]
[0052] 図１７Ｃは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が、ｓｉＲＮＡへの２１ｎｔ以上のＲＮＡデュプレックスのダイサー酵素プロセシングを、抑制および阻害することを示す。図１７Ｃは、「２／２」２’−Ｏ−Ｍｅ化学構造を有する２５−ｂｐＲＮＡデュプレックスのプロセシングの定量を示す。部分的にプロセシングされたバンドの密度をＬａｂＷｏｒｋｓ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量した。] 図１７Ｃ
[0053] 図１７ＤおよびＥは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾が、ｓｉＲＮＡへの２１ｎｔ以上のＲＮＡデュプレックスのダイサー酵素プロセシングを、抑制および阻害することを示す。図１７Ｄは、本明細書中に記載のように組換ヒトダイサー酵素とともに一晩インキュベーションした後の、デュプレックスの各末端上に異なる組合せの（４）２’−Ｏ−Ｍｅを有するＲＮＡデュプレックスのＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルである。図１７Ｅは、ＳＯＤ１遺伝子中の異なる配列を標的とする２’−Ｏ−Ｍｅ修飾された２５−ｂｐデュプレックスにより得られた類似の結果を示す。]
[0054] 表１は、ＳＯＤ１およびＰＰＩＢに対する代替ＲＮＡｉ化合物の配列を提供する。全配列名を、遺伝子名−開始部位—長さ—代替ＲＮＡｉ化合物ＩＤ番号で表す。「Ｐ」は５’リン酸塩を表す一方、「ｍ」は２’Ｏ−メチル塩基修飾を表す。「Ｆ」は２’フルオロ基塩修飾を表す。「＊」はホスホチオエート骨格結合を意味する一方、「．」は通常のＲＮＡ骨格結合を表す。]
[0055] 表２は、ＳＯＤ１に対する追加の代替ＲＮＡｉ化合物の配列を提供する。表１中で用いた表記法は表２へ適用する。]
[0056] 表３は、ＲＮＡデュプレックスのリストである。一本鎖ＲＮＡまたはデュプレックスＲＮＡを化学的に合成して、方法欄に記載のようにアニールした。「Ｇ」＝グアニン、「Ｕ」＝ウラシル、「Ｃ」＝シトシン、「Ａ」＝アデニン、「ｍ」＝２’Ｏメチル塩基修飾、「．」＝通常のＲＮＡ骨格結合。方向性は、ＰＳ＝パッセンジャーまたはセンス鎖、ＧＳ＝ガイドまたはアンチセンス鎖、として表す。括弧内の数字は、デュプレックス追跡のための内部配列データベース番号に対応する。]
[0057] 表４は、上記の一部の図におけるＲＮＡデュプレックスのリストである。一本鎖ＲＮＡまたはデュプレックスＲＮＡを化学的に合成して、方法欄に記載のようにアニールした。「Ｇ」＝グアニン、「Ｕ」＝ウラシル、「Ｃ」＝シトシン、「Ａ」＝アデニン、「ｍ」＝２’Ｏメチル塩基修飾されたもの、「．」＝通常のＲＮＡ結合。方向性は、ＰＳ＝パッセンジャーまたはセンス鎖、ＧＳ＝ガイドまたはアンチセンス鎖、として表す。括弧内の数字は、デュプレックス追跡のための内部配列データベース番号に対応する。]
[0058] 表５は、ＲＮＡサイズマーカーおよび切断アッセイで用いた合成基質のリストである。]
[0059] １．概説
本発明は、あるより長いｄｓＲＮＡ（例として、２１塩基対を超える二本鎖領域を有するもの）が、センス鎖が修飾された（例として、センス鎖の両末端が例えば２’−Ｏ−メチル基によって）場合に、ダイサーまたは他のダイサー様ＲＮＡｓｅＩＩＩによって切断されず、かかるｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端が２１マー（すなわちダイサー切断産物）の５’末端と並んだ状態でＲＩＳＣ複合体に取り込まれ得るという驚くべき発見に部分的に基づいている。先行技術が、化合物がダイサーの基質を形成する場合、ＲＮＡｉ化合物活性は（ｓｉＲＮＡと比較して）増大すると教示しているにもかかわらず、本出願人らは実際に、ダイサーの基質ではない非常に活性なＲＮＡｉ化合物を見出した。本発明はまた、かかるより長いアンチセンス（ガイド）鎖を取り込んだＲＩＳＣ複合体が、標的ｍＲＮＡを、アンチセンス（ガイド）配列の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の位置に対応する単一位置で切断するものであるという発見に部分的に基づいている。]
[0060] 本出願人らの発見が直接的に意味することは、かかるより長いｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は単一種の活性ＲＮＡｉ試薬となり、したがってより高い標的特異性、より明確な生物学的活性および／または薬理学的特性を有したＲＮＡｉ試薬または治療薬の開発を促進することである。
さらに、より長いｄｓＲＮＡがダイサー切断に対して抵抗性であるように操作することができるという知識、およびダイサー抵抗性アンチセンス鎖が定義された場所でＲＩＳＣ複合体に取り込まれて単一種の活性ＲＮＡｉ試薬を創造することができるという知識により、人はセンスおよび／またはアンチセンス鎖に付加的な特徴または修飾を施し、ＲＮＡｉ試薬または治療薬の特性を改善することができる。特に、５’−末端に関するガイド鎖中の修飾位置を今や定義することができ、この位置がかかる修飾ＲＮＡｉ化合物の特異性および活性の定義に重要である。]
[0061] 代表的な標的遺伝子スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を用いて、本出願人らは幾多のセンスおよびアンチセンス修飾およびその組み合わせを設計および試験して、長いｄｓＲＮＡをダイサー抵抗性にし、その上効果的な標的遺伝子サイレンシングおよび／または多くの他の付随する利益を提供する複数の特異的修飾を同定した。]
[0062] したがって１つの側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0063] ある態様において、アンチセンス鎖が非修飾である。他の態様において、アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−修飾リボース糖を含む。
本明細書で用いられる場合、「２’−修飾リボース糖」は、２’−ＯＨ基を有さないリボース糖を含む。例えば、２’−修飾リボース糖は２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ（デオキシリボヌクレオチド）、またはそれらの組み合わせであってよい。]
[0064] ある態様において、上述のアンチセンス修飾を有する本発明のｄｓＲＮＡは、特定のアンチセンス修飾を有さない類似のコンストラクトと比較して、顕著に（例として、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上）低い「オフターゲット」遺伝子サイレンシングを示し、したがって全体的にＲＮＡｉ試薬または治療薬の特異性を大きく改善する。]
[0065] 本明細書で用いられる場合、「オフターゲット」遺伝子サイレンシングは、例えばアンチセンス（ガイド）配列と意図しない標的ｍＲＮＡ配列との間の誤った(spurious)配列ホモロジーに起因する、意図しない遺伝子サイレンシングをいう。]
[0066] 別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の３’−末端において、（ｉ）非加水分解性のヌクレオチド間結合を有する少なくとも４つの連続した２’−修飾リボース糖（ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の２’−修飾リボース糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖、または（ｉｉｉ）保護基を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0067] 本発明のこの側面によれば、あるアンチセンス修飾は、顕著にＲＮＡｉ活性を低減することなく（またはＲＮＡｉ活性を全く低減させずに）、さらにヌクレアーゼ安定性を増大し、および／またはインターフェロン誘導をより低める。]
[0068] 別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有し、該センス鎖が、該センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含む、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0069] 本発明のこの側面によれば、センス鎖の３’−末端におけるあるミスマッチが、該アンチセンス鎖のＲＩＳＣ複合体へのより効果的な取り込みを可能にし、したがって、より強力なＲＮＡｉ活性を導く。好ましいかかるセンス鎖ミスマッチは、センス鎖の最後から２番目のヌクレオチド（ＲＩＳＣ複合体中のダイサー抵抗性アンチセンス鎖の２番目のヌクレオチドと塩基対を形成するもの）、およびセンス鎖の最も３’−末端側のヌクレオチドを除く最も３’−末端側の９ヌクレオチドを含む。]
[0070] 異なるセンスおよび／またはアンチセンス鎖修飾など、本発明の異なる特徴は、他に示された場合を除いて、従来のｓｉＲＮＡコンストラクトに対する複数の利点または特徴を有するＲＮＡｉコンストラクトを創造するために組み合わされてよい。
例えば、本発明の全ての適用可能な側面について、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドなどの２’−修飾リボース糖を、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに含んでよく、好ましくは他の修飾ヌクレオチドを含まない。かかる修飾を有するｄｓＲＮＡは、前記位置に２’−Ｏ−メチル修飾を有さない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する。]
[0071] 本発明の全ての適用可能な側面について、アンチセンス鎖は少なくとも４つ一続きの、２’−Ｏ−メチル修飾などの２’−修飾リボース糖、ホスホチオエート結合などの非加水分解性ヌクレオチド間結合を有する３’−末端ヌクレオチドを含んでよい。
本発明の全ての適用可能な側面について、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’−末端の１０番目と１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断されてよい。]
[0072] 本発明の全ての適用可能な側面について、２５マーの５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドは２’−修飾リボース糖であってよい。修飾塩基の数は、コンストラクトの全体的な長さに依存して調整してよい。例えば、２７マーについて、５’−末端の１２〜１４ヌクレオチドおよび３’−末端の１０〜１２ヌクレオチドは２’−修飾ヌクレオチドであってもよい、などである。]
[0073] 本発明の全ての適用可能な側面について、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含んでよい。
特定のアンチセンスおよびセンス鎖修飾のある組み合わせは、標的遺伝子発現を阻害する増強された能力、増強された血清安定性、および／または増大した標的特異性などによって部分的に明らかにされたように、予測できない利点となり得る。]
[0074] したがって、別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、該センス鎖の前記５’−および３’−末端に４つの連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが存在し、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｂ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0075] 別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９（好ましくは１９〜４９）ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、１２および１０の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドをそれぞれ５’−末端および３’−末端に含む、および、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）非修飾である、（ｂ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｃ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクトを提供する。]
[0076] ある態様において、主題のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位における、標的遺伝子の転写産物の一様な切断を導く。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、該センス鎖の３’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断可能である。]
[0077] 本発明のこの態様によれば、あるセンス鎖配列は、等価なｍＲＮＡが切断される部位において、ダイサー抵抗性ガイド配列を取り込んだＲＩＳＣ複合体によって切断され得る。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、これは１つにはセンス鎖が標的ｍＲＮＡと同一のまたは類似の配列を共有することが理由である。したがって、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトは、１０番目および１１番目の３’−末端ヌクレオチドの間で切断され得るセンス鎖を有するものを含む。]
[0078] 本発明のコンストラクトは異なる長さを有していてもよい。ある態様において、好ましい長さのコンストラクトは１２〜３５、または１２〜４９、好ましくは１９〜４９ヌクレオチドの長さである。ある態様において、コンストラクトの長さは、２２ヌクレオチドの長さより長いかまたは同じである。ある態様において、コンストラクトの長さは、２５ヌクレオチドの長さより長いかまたは同じである。ある態様において、コンストラクトの長さは、２６、２７、２８、２９、３０、または３１〜４９ヌクレオチドの長さである。長さの下限がダイサー基質にとっての最短の長さであり、上限が一般的に標的細胞においてＰＫＲ応答を惹起しない長さである限り、他の長さもまた可能である。ある態様において、修飾は、より長い長さ（５０、６０、７０、８０、９０、１００ｂｐなど）が許容され得るように、上限を変化させ得る。]
[0079] ある態様において、ｄｓＲＮＡコンストラクトは平滑末端である。他の態様において、１〜４ヌクレオチドの５’−および／または３’−末端オーバーハングが１つのまたは両方の鎖に存在する。
２５マーコンストラクトについて、センス鎖の各末端が、独立して、４〜１６個の２’−修飾ヌクレオチドおよび／または非加水分解性結合（例として、ホスホチオエート結合）を含んでよい。修飾塩基の数はコンストラクトの全体的な長さに依存して調整されてよい。例えば２７マーについて、センス鎖の各末端が、独立して、４〜１８個の２’−修飾ヌクレオチドおよび／またはホスホチオエート結合を含んでよい、などである。]
[0080] ある態様において、センス鎖の５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドが２’−修飾リボース糖である。
ある態様において、センス鎖の各末端は同じ数または異なる数の２’−修飾リボース糖を有してよいが、各末端が一続きの２’−修飾リボース糖を含む。
ある態様において、センス鎖の各末端が４つ一続きの２’−修飾リボース糖を含む。]
[0081] ある態様において、アンチセンス鎖が、非連続的な２’−修飾リボース糖を含み、ここで１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない。例えば、アンチセンス鎖は、各２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドの２’−修飾リボース糖を含んでよい。アンチセンス鎖上の最も５’−末端側の２’−修飾リボース糖は、２番目のヌクレオチド、または最初のヌクレオチドであってよい。]
[0082] ある態様において、２’−修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ−（デオキシリボヌクレオチド）またはそれらの組み合わせである。
ある態様において、２’−修飾ヌクレオチドが、ピリミジンヌクレオチド（例として、Ｃ／Ｕ）である。
例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、または２’−Ｏ−アリルヌクレオチドであってよい。]
[0083] ある態様において、アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端の２番目に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない。
ある態様において、修飾ｄｓＲＮＡが、同一の配列を有する非修飾のｄｓＲＮＡと比較して、血清および／または脳脊髄液中での改善された安定性を有し得る。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、２’−修飾を前記の位置に含まない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する。]
[0084] ある態様において、アンチセンス鎖が、ホスホチオエート結合を有する少なくとも４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む。
ある態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、ミスマッチヌクレオチドを含む。
ある態様において、センス鎖の３’−末端における最後から２〜８番目のヌクレオチドが、それらの対応するアンチセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチである。]
[0085] ある態様において、ｄｓＲＮＡが、ヒト、マウスおよび他の齧歯類、ならびに他の非ヒト哺乳類からの初代細胞を含む、哺乳類初代細胞などの初代細胞において、インターフェロン応答を誘導しない。
ある態様において、ｄｓＲＮＡが、無脊椎動物中の標的遺伝子の発現を阻害するために用いられてもよい。
ある態様において、５’−末端から１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない。]
[0086] in vivoでの主題のコンストラクトの安定性をさらに増大させるため、センス鎖のいずれかの末端および／またはアンチセンス鎖の３’−末端が、保護基によってブロックされていてよい。例えば、反転ヌクレオチド（inverted nucleotide）、反転脱塩基部分（inverted abasicmoieties）、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドなどの保護基を用いてよい。反転ヌクレオチドは、反転デオキシヌクレオチドを含んでよい。反転脱塩基部分は、３’，３’−連結または５’，５’−連結デオキシ脱塩基部分などの反転デオキシ脱塩基部分を含んでよい。]
[0087] ある態様において、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の交互ヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を含み、各２’−修飾リボース糖が、逆鎖上の非修飾のヌクレオチドと向き合う。ある態様において、最初の２’−修飾アンチセンスヌクレオチドが、最も５’−末端のアンチセンスヌクレオチドであるか、またはアンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドである。]
[0088] ある態様において、本明細書に記載されたあらゆる代替的ＲＮＡｉ化合物と同一のまたは類似の構造を有するが、ダイサー切断に対して抵抗性でない点で異なるＲＮＡｉコンストラクトもまた、それぞれの意図された標的（例として、ｍＲＮＡ）に対して高い活性を示す限り、望ましい。]
[0089] ある態様において、主題の二本鎖ＲＮＡが、１または２以上の点において化学的に相互連結されていてよく、あるいは１または両方の末端においてヌクレオチドループ構造によって連結（例として、一本鎖ヘアピン構造または環状構造）されていてよい。１つの態様において、化学的な相互連結またはヘアピン構造のループが、アンチセンス鎖の３’−末端にある（例として、アンチセンス鎖の３’−末端をセンス鎖の５’−末端に連結する）。別の態様において、化学的な相互連結またはヘアピン構造のループが、アンチセンス鎖の５’−末端にある（例として、センス鎖の３’−末端をアンチセンス鎖の５’−末端に連結する）。これらの態様において、センス鎖上の５’−末端および３’−末端修飾および／またはアンチセンス鎖上の他の修飾などの、相互連結またはループしたコンストラクトの他の構造的特長は、本明細書に記載されたｄｓＲＮＡのものと本質的に同一である。]
[0090] 本発明の二本鎖および／またはデュプレックス（duplex）オリゴヌクレオチドコンストラクトは、標的遺伝子によってコードされるあらゆる標的タンパク質の合成を阻害することができる。本発明は、in vitroまたはin vivoいずれかで標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。標的遺伝子は、細胞に対して内因性のものでも外因性のもの（例として、ウィルスによりまたは組換えＤＮＡ技術を用いて細胞に導入される）でもあり得る。かかる方法は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量の、ＲＮＡの細胞内への導入を含んでよく、ここでＲＮＡは二本鎖デュプレックスである。例示の目的で、かかるＲＮＡ分子は標的遺伝子のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を有する第一の鎖、および標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なリボヌクレオチド配列を有する第二の鎖を有してよく、ここで、第一および第二の鎖は別々の相補的な鎖であり、デュプレックス組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように、それらが互いにハイブリダイズして前記二本鎖分子を形成する。本発明の一般的な原則を解説するために本出願において広く用いられている代表的な（しかし限定するものではない）標的遺伝子は、ごく一部を挙げると、ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、ＲＩＰ１４０、ＰＣＳＫ９、ＴＮＦα、ＡＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質、またはＭＡＰ４Ｋ４を含む。]
[0091] いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、ＲＮＡｉの実体の「センス」鎖上の２’−Ｏ−メチルブロック領域（センス鎖の末端部分における領域など）の存在は、かかる修飾のないコンストラクトと比較して、安定性、特異性を顕著に増大し、免疫応答を最小化する。いくつかの場合において、アンチセンス鎖に対して修飾を適用することによってＲＮＡｉデュプレックスの安定性をさらに増大することは、より有益であり得る。特に、いくつかの好ましい化学修飾パターンは、含有するＣおよびＵの大部分が２’−Ｏ−メチルによって修飾されているか、または含有するＣおよびＵの大部分が２’Ｆによって修飾されているアンチセンス鎖を含んでよい。いくつかの場合において、アンチセンス鎖は数個の化学修飾の混合によって修飾されてもよい。]
[0092] ある態様において、重度に修飾されたアンチセンス鎖は、キナーゼにとってよい基質ではない可能性がある。したがって、この問題を緩和するためにアンチセンス鎖の化学的リン酸化を用いてよい。加えて、いくつかの好ましい配列は、センス鎖の非修飾領域にプリンヌクレオチド（すなわちＡおよびＧ）のみを含んでよく、または／および２’−Ｆもしくはホスホロチオエート（ＰＳ）を含んでいてよい。いくつかの場合において、２’−Ｏ−メチルおよび２’Ｆと組み合わせたＰＳ修飾の追加の導入が好ましいだろう。]
[0093] いくつかの場合において、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の修飾が、コンストラクトの最大の安定性を達成するのに好ましい。重度に修飾されたデュプレックスは時としてＲＩＳＣ会合体にとって粗悪な基質であるので、いくつかの好ましい態様において、１つまたは複数のバルジ（例として、サイズにして約１〜５つのヌクレオチド）が、ＲＩＳＣ移行(entry)および効力に必要であるかまたは少なくとも有用であり得る。]
[0094] いくつかの他の態様において、重度に修飾されたデュプレックスは、センス鎖に単一ニックを含んでよい。好ましいニック位置は、アンチセンス鎖の５’末端から１０ｂｐの逆鎖上であってよい。いくつかの態様において、ニックは上述の好ましい位置（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から１０ｂｐの逆鎖上）から５ｂｐ以内に位置することができる。いくつかの態様において、デュプレックス安定性を提供する追加の化学的修飾が、主題のコンストラクトに適用されてよい。いくつかの態様において、配列は、例として各デュプレックス領域のΔＧが−１３ｋｃａｌ／モルとなるなどの、熱力学的特徴を有するように選択されてよい。]
[0095] したがって、ある態様において、本発明のコンストラクトは、ある修飾をセンス／パッセンジャー鎖またはアンチセンス／ガイド鎖のいずれか、あるいは両方に含んでよく、ある利点をコンストラクトに付与してよい。
例えば、ある態様において、２’−修飾ヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチド（例として、センス鎖の中央部分または一続きの部分）が２’−Ｆ修飾である。代替的にまたはそれに加えて、センス鎖の同一の部分が、それぞれ約１〜５ヌクレオチドのバルジなど、１または２以上のバルジを形成してもよい。]
[0096] 本明細書で用いられる場合、一続きの２’−修飾リボースヌクレオチドは、かかる一続きの部分が好ましくは末端ヌクレオチドから開始されても、５’−末端または３’−末端から開始される必要はない。したがって、ある態様において、一続きの２’−修飾リボースヌクレオチドは、独立して、末端ヌクレオチド、末端ヌクレオチドから二番目のヌクレオチド、末端ヌクレオチドから三番目のヌクレオチドなどから開始される。]
[0097] ある態様においてアンチセンス鎖の５’−末端はリン酸化されていてよい。
ある関連した態様において、本発明はまた、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡコンストラクト、ここで該コンストラクトのセンス鎖上の単一ニック以外は上述の任意のｄｓＲＮＡと同一である、を提供する。したがって、これらの態様において、ＲＮＡコンストラクトは実際のところ、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖構造を形成する３つのポリヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖は一本鎖ポリヌクレオチドであり、一方で他の２つのポリヌクレオチドは両方ともアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書に記載された他の任意のｄｓＲＮＡコンストラクトに対応する「センス鎖」を形成する。]
[0098] ニックの場所は、この態様において異なってよい。例えば、ニックが、アンチセンス鎖の５’末端から約１０塩基のヌクレオチドの逆位置を占めてもよい。代替的に、ニックはこの位置から５ヌクレオチド以内（例として、アンチセンス鎖の５’末端から約５〜１５塩基のヌクレオチドの逆位置を占める）であってよい。このタイプのコンストラクト中の二本鎖領域の配列は、各デュプレックス領域のΔＧが約−１３ｋｃａｌ／モル未満となるように選択されてもよい。]
[0099] 本発明はまた、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトの少なくとも１本の鎖を発現するベクター、およびかかるベクターまたは主題のｄｓＲＮＡコンストラクトを含む細胞に関する。細胞は、ヒト細胞などの、培養哺乳類細胞であってよい。
本発明はさらに、主題のｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物に関する。]
[0100] 本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と、任意の主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
本方法は、例えば培養ヒト細胞などの培養哺乳類細胞において、in vitroまたはin vivoで行われてよい。
標的細胞（例として、哺乳類細胞）は、脂質（例としてカチオン性脂質）またはリポソームなどの送達試薬の存在下で接触させてよい。]
[0101] 本発明の別の側面は、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と主題のｄｓＲＮＡコンストラクトの少なくとも１つの鎖を発現するベクターとを接触させることを含む、前記方法を提供する。
本発明の別の側面は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング効果を改良するための方法であって、ｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンスヌクレオチドを修飾して、主題のｄｓＲＮＡコンストラクトとすることを含む、前記方法を提供する。]
[0102] 本発明の別の側面は、ｓｉＲＮＡコンストラクトの標的部位へのin vivo送達を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡコンストラクトとともに、ほとんど全ての組織において普遍的に発現するユビキタス遺伝子であるＰＰＩＢを標的とする主題のｄｓＲＮＡコンストラクトを共送達し、標的部位におけるＰＰＩＢ機能の阻害をアッセイすることを含み、ここでＰＰＩＢ機能の標的部位における成功裡の阻害が、標的部位へのｓｉＲＮＡコンストラクトのin vivo送達成功の指標となる、前記方法を提供する。
本発明のより詳細な側面は、以下のセクションにおいて記載される。]
[0103] ＩＩ．デュプレックス構造
デュプレックスの特徴
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々の相補的核酸鎖によって形成されてよい。デュプレックス形成は標的遺伝子を含む細胞の内側または外側で起こり得る。
本明細書で使用される場合、「二本鎖」という語は、少なくともヌクレオモノマーの一部が相補的であり、水素結合してデュプレックスを形成する分子の領域を含む１または２以上の核酸分子を含む。]
[0104] 本明細書で使用される場合、「デュプレックス（duplex）」という語は、相補的配列と水素結合する二本鎖の核酸分子の領域を含む。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列および標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含んでよい。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列に相当し、例として、同一または標的遺伝子に対して標的遺伝子阻害をもたらすのに十分に同一（例として、少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一または８０％同一）である。]
[0105] ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、すなわちオーバーハングする一本鎖配列をどちらの両端にも有さず、すなわち平滑末端である。他の態様において、個々の核酸分子が異なる長さであり得る。言い換えれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、二つの別々の核酸分子が用いられる場合、１つの核酸分子、例としてアンチセンス鎖を含む第一の分子、はそれにハイブリダイズする第二の分子よりも長いものであり得る（分子の一部分が一本鎖のまま）。同様に、単一の核酸分子が用いられる場合、いずれかの末端における分子の一部分が一本鎖のままであり得る。]
[0106] 1つの態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはミスマッチおよび／またはループもしくはバルジを含むが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖となっている。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖となっている。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％〜９５％にわたって二本鎖となっている。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％〜９８％にわたって二本鎖となっている。ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のミスマッチを含む。]
[0107] 修飾
本発明のヌクレオチドは、糖部分、ホスホジエステル結合および／または塩基を含む様々な場所で修飾されていてよい。
糖部分は、例としてモノサッカライド（ペントース、例としてリボース、デオキシリボース、など）、天然の非修飾糖、修飾糖および糖アナログを含む。一般的に、ヌクレオモノマー、特に糖部分、の可能な修飾は、例えば１または２以上のヒドロキシル基のハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基との置き換え、またはヒドロキシル基のエーテル、アミン、チオールなどとしての官能化を含む。]
[0108] １つの特に有用な修飾ヌクレオモノマーのグループは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。かかる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、「メチル化」と呼ぶこともでき、対応するヌクレオチドは、非メチル化ヌクレオチドからアルキル化により、またはメチル化されたヌクレオチド試薬から直接作られてよい。修飾ヌクレオチドを非修飾ヌクレオチドと組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはメチル化および非メチル化ヌクレオモノマーを両方含んでよい。]
[0109] いくつかの代表的な修飾ヌクレオモノマーは、糖または主骨格修飾リボヌクレオチドを含む。修飾リボヌクレオチドは、５’−位で修飾されたウラジンまたはシチジン、例として５’−（２−アミノ）プロピルウラジンおよび５’−ブロモウラジン；８−位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例として８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例として７−デアザ−アデノシン；およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例としてＮ６−メチルアデノシンなどの非天然の塩基（天然塩基の代わりに）を含んでよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、Ｈ、アルコキシ（またはＯＲ）、Ｒまたはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）またはＣＮ基、ここでＲは低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである、で置き換えられた２’−ＯＨ基を有してよい。]
[0110] 修飾リボヌクレオチドはまた、修飾基によって置換された隣接リボヌクレオチドと接続するリン酸エステル基、例としてホスホチオエート基、を有していてもよい。より一般的には、様々なヌクレオチド修飾が組み合わされてよい。]
[0111] １つの態様において、センスオリゴマーは、２’−修飾を末端に有してもよい（例として、各末端に２つ、各末端に３つ、および各末端に４つなど；同様に１つの末端に１つ、１つの末端に２つ、１つの末端に３つ、および１つの末端に４つ；ならびにさらに、１つの末端に１２個および他の末端に１０個などの、アンバランスな組み合わせ）。同様に、アンチセンス鎖は２’−修飾を末端に有してもよい（例として、各末端に２つ、各末端に３つ、および各末端に４つなど；同様に１つの末端に１つ、１つの末端に２つ、１つの末端に３つ、および１つの末端に４つ；ならびにさらに、１つの末端に１個および他の末端に２個などの、アンバランスな組み合わせ）。好ましい側面において、２’−修飾は、センスＲＮＡ鎖および／またはアンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾である。]
[0112] 本発明によれば、センス鎖は、中央の連結が非修飾である限り、多くの２’−修飾（２’−Ｏ−メチル修飾など）を許容し得る。本明細書で用いられる場合、「中央」は、センス鎖の幾何学的な中央点を意味するとは限定されない。むしろ、センス鎖の５’−末端部および３’−末端部の間の任意の場所を含み得る。センス鎖の５’−末端部および３’−末端部は、対称的である必要はない。]
[0113] したがって、ある態様において、センス鎖は完全には修飾されていない（すなわち、少なくとも１または２以上のセンス鎖ヌクレオチドが非修飾である）。ある態様において、非修飾のセンス鎖ヌクレオチドがセンス鎖の中央部にあり、または５’−末端上の一続きの修飾センス鎖ヌクレオチドおよび３’−末端上の一続きの修飾センス鎖ヌクレオチドの間にある。]
[0114] また本発明によれば、センス鎖の２’−修飾についての許容性は、必ずしも対称的でなくてよい。むしろ、非対称の形状は、例えば２５または２６ヌクレオチドのセンス鎖を使用する場合に望ましいことがある。２’−修飾はヌクレアーゼ安定性を付与し、およびインターフェロン誘導を低減し、および合成が容易である。したがって、本発明の教示がＲＮＡｉ活性を保存する限り、より多くのかかる２’−修飾リボース糖（特に２’−Ｏ−メチル修飾）をセンス鎖上に含むことが望ましいことがある。]
[0115] 本発明のいくつかの態様において、最大のガイド鎖活性を可能にするために、主題の高度に修飾されたセンス鎖は、非修飾であるかまたは軽度に修飾されたアンチセンス鎖と組み合わされてよい。
エンド−およびエクソ−ヌクレアーゼ抵抗性をさらに最大化するために、２’−修飾ヌクレオモノマーを末端に使用するのに加えて、ホスホジエステル以外のヌクレオモノマー間結合を用いてよい。例えば、かかる末端ブロックは単独でまたは２’−Ｏ−メチル連結の間のホスホチオエート結合と組み合わせて用いてよい。好ましい２’−修飾ヌクレオモノマーは２’−修飾末端ヌクレオチドである。]
[0116] アンチセンス鎖は、標的遺伝子（または遺伝子群）の少なくとも一部と、少なくとも塩基対合特性に関して、実質的に同一であり得るけれども、例として標的遺伝子のフェノタイプの発現を阻害するのに、有用であるためには配列が完全に同一である必要はない。一般的に、高いホモロジーは、より短いアンチセンス遺伝子の利用を代償するために用いることができる。いくつかの場合において、アンチセンス鎖は一般的に、標的遺伝子と実質的に同一（アンチセンス方向ではあるけれども）であろう。]
[0117] 本発明の組成物の１つの好ましい例は、センスオリゴヌクレオチドの両末端およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’−末端のみに末端ブロックを有する。理論に束縛されるものではないが、おそらく効果的にほどけないために、２’−Ｏ−修飾センス鎖は、その非修飾版よりも良好に機能し得ない。したがって、ある態様において、ＲＩＳＣ複合体への容易な取り込みを促進するために、ミスマッチがセンス鎖（修飾された２’−Ｏ−メチルセンス鎖、または非修飾のセンス鎖であっても）の特定の位置に導入されてよい。]
[0118] いくつかの態様において、センス鎖の長さは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチドであり得る。同様に、アンチセンス鎖の長さは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチドであり得る。さらに、かかるセンスおよびアンチセンス分子から二本鎖核酸分子が形成された場合、得られるデュプレックスは、平滑末端または０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチドのオーバーハングを、１つの末端または独立してそれぞれの末端に有していてよい。さらに、本発明の二本鎖核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成されてよく、ここでこれらの鎖は上述の長さであり、これらは同一または異なる長さであり、しかし１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドの配列相補性のみを共有する。例として、センス鎖が２０ヌクレオチドの長さであり、アンチセンスが２５ヌクレオチドの長さであり、２つの鎖が１５ヌクレオチドの配列相補性のみを共有する状況において、二本鎖核酸分子を、１０ヌクレオチドのオーバーハングを１つの末端に有し、５ヌクレオチドのオーバーハングを他方の末端に有して形成し得る。]
[0119] ２’−Ｏ−メチルＲＮＡはまた、細胞のストレス応答を最小化することが望ましいという状況においても有益である。２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマーを有するＲＮＡは、非修飾のＲＮＡを認識すると考えられている細胞機構に認識され得ない。２’−Ｏ−メチル化された、または部分的に２’−Ｏ−メチル化されたＲＮＡは、標的ＲＮＡ阻害を維持する一方で、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答を回避し得る。このことは、例えば、インターフェロン応答を誘発する短鎖ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ）配列、およびインターフェロン応答を誘発し得る長鎖ＲＮＡｉ配列の両方において、インターフェロンまたは他の細胞性ストレス応答を回避するのに有用であり得る。]
[0120] 概して、修飾糖は、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）すなわち２’−Ｏ−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、およびシアノなどを含んでよい。１つの態様において、糖部分はヘキソースであり得、記載されたようにオリゴヌクレオチドに組込まれ得る（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:471 1 (1992)）。代表的なヌクレオモノマーは、例としてＵＳ特許第５，８４９，９０２号に見出すことができ、本明細書に参照として組込まれる。]
[0121] 「アルキル」という語は、直鎖アルキル基（例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖のアルキルは、６またはそれより少ない炭素原子をその骨格に有し（例として、直鎖についてＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４またはそれより少ない。同様に、好ましいシクロアルキルは、３〜８個の炭素原子をその環構造中に有し、より好ましくは５または６の炭素を環構造中に有する。Ｃ１〜Ｃ６という語は１から６個の炭素原子を含むアルキル基を含む。]
[0122] さらに、特別の定めのない限り、アルキルという後は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素原子上の水素原子を置き換えている独立して選択される置換基を有するアルキル部分をいう。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分を含むことができる。シクロアルキルは、例として上記の置換基でさらに置換され得る。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例としてフェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」という語はまた、天然および非天然アミノ酸の側鎖を含む。「ｎ−アルキル」という語は、直鎖（すなわち分岐していない）非置換アルキル基を意味する。]
[0123] 「アルケニル」という語は、長さおよび可能な置換において上記アルキルと同様であるが、少なくとも１つの二重結合を含む、不飽和の脂肪族基を含む。例えば「アルケニル」という語は、直鎖アルケニル基（例として、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、６またはそれより少ない炭素原子をその骨格に有する（例として、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。同様に、好ましいシクロアルケニルは、３〜８個の炭素原子をその環構造中に有してよく、より好ましくは５または６の炭素を環構造中に有する。Ｃ２〜Ｃ６という語は２から６個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。]
[0124] さらに、特別の定めのない限り、アルケニルという後は、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素原子上の水素原子を置き換えている独立して選択される置換基を有するアルケニル部分をいう。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分を含むことができる。]
[0125] 「アルキニル」という語は、長さおよび可能な置換において上記アルキルと同様であるが、少なくとも１つの三重結合を含む、不飽和の脂肪族基を含む。例えば「アルキニル」という語は、直鎖アルキニル基（例として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、６またはそれより少ない炭素原子をその骨格に有する（例として、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。Ｃ２〜Ｃ６という語は２から６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。]
[0126] さらに、特別の定めのない限り、アルキニルという後は、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素原子上の水素原子を置き換えている独立して選択される置換基を有するアルキニル部分をいう。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルケニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分を含むことができる。]
[0127] 炭素数が他に特別の定めのない限り、本明細書で用いられる場合「低級アルキル」は上記で定義された通りであるが１から５個の炭素原子をその主骨格構造に有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば２〜５個の炭素原子の鎖長を有する。]
[0128] 「アルコキシ」という語は、酸素原子に共有結合する置換および非置換のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分などの独立して選択される基で置換され得る。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、これに限定するものではないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。]
[0129] 「ヘテロ原子」という語は、炭素または水素以外の任意の要素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄およびリンである。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という語は、−ＯＨまたは−Ｏ−（適切な対イオンを伴って）を含む。
「ハロゲン」という語は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。「パーハロゲン化」は一般的に、全ての水素原子がハロゲン原子で置き換えられた基をいう。]
[0130] 「置換（された）」という語は、部分上に置かれ得、分子が意図された機能を実行できるようにすることができる、独立して選択される置換基を含む。置換基の例は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）１〜２ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）０〜２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯ２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＯＲ’基、ここで各Ｒ’およびＲ’’はそれぞれ独立して水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、またはアリール基、あるいはＲ’およびＲ’’が一緒になってベンジリデン基または−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基となる、を含む。]
[0131] 「アミン」または「アミノ」という語は、窒素原子が少なくとも１つの炭素またはヘテロ原子と共有結合している化合物または部分を含む。「アルキルアミノ」という語は、窒素原子が少なくとも１つの追加のアルキル基と結合している基または化合物を含む。「ジアルキルアミノ」という語は、窒素原子が少なくとも２つの追加のアルキル基と結合している基または化合物を含む。]
[0132] 「エーテル」という語は、２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子と結合する酸素を含む化合物または部分を含む。例えば、この語は、別のアルキル基と共有結合している酸素原子と共有結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基をいう「アルコキシアルキル」を含む。]
[0133] 「塩基」という語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環塩基、デアザプリン、およびそのアナログ（複素環置換アナログ、例としてアミノエチオキシフェノキサジン、を含む）、誘導体（例として、ｌ−アルキル−、ｌ−アルケニル−、ヘテロ芳香族−およびｌ−アルキニル誘導体）、および互変異性体を含む。プリンの例は、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリンおよびキサンチン、およびそのアナログ（例として、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）および誘導体を含む。ピリミジンは、例えばチミン、ウラシルおよびシトシン、およびそのアナログ（例として５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシン）を含む。他の好適な塩基の例は、２−アミノピリジンおよびトリアジンなどの非プリニルおよび非ピリミジニル塩基を含む。]
[0134] 好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、ＲＮＡヌクレオチドである。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。したがって、オリゴヌクレオチドは修飾ＲＮＡヌクレオチドを含む。
「ヌクレオシド」という語は、糖部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボース、に共有結合している塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例は、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはまた、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、または保護基を含んでもよいアミノ酸またはアミノ酸アナログに連結する塩基を含む。好適な保護基は当該技術分野において周知である（P. G. M. Wuts and T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1999参照）。]
[0135] 「ヌクレオチド」という語は、さらにリン酸基またはリン酸アナログを含むヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される場合、「連結（linkage）」という語は、隣接するヌクレオモノマーを共有的に結びつける、天然の、非修飾ホスホジエステル部分（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を含む。本明細書で使用される場合、「置換連結」という語は、隣接するヌクレオモノマーを共有的に結びつける、自然のホスホジエステル基の任意のアナログまたは誘導体を含む。置換連結は、ホスホジエステルアナログ、例としてホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびＰ−エチオキシホスホジエステル、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および非リン含有連結、例としてアセタールおよびアミド、を含む。かかる置換連結は当該技術分野において公知である（例として、Bjergarde et al., 1991, Nucleic AcidsRes. 19:5843; Caruthers et al., 1991, Nucleosides Nucleotides, 10:47）。ある態様において、非加水分解性連結は、好ましくは、ホスホロチエート結合などである。]
[0136] ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’および５’末端を含む（環状オリゴヌクレオチドを除く）。１つの態様において、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端は、例として３’または５’連結を修飾することにより（例として米国特許第５，８４９，９０２号およびＷＯ９８／１３５２６）、ヌクレアーゼから実質的に保護されている。例えば、「ブロッキング基」の包含により、オリゴヌクレオチドを抵抗性にすることができる。本明細書において使用する場合の「ブロッキング基」という語は、合成のための保護基としてまたはカップリング基として（例として、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、ホスフェート（ＰＯ３２−）、亜リン酸（hydrogen phosphonate）、またはホスホロアミダイト）、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに取り付けることができる置換基（例としてＯＨ基以外）をいう。「ブロッキング基」はまた、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端を保護する「末端ブロッキング基」または「エクソヌクレアーゼブロッキング基」を含み、これらは修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエクソヌクレアーゼ抵抗性構造を含む。]
[0137] 代表的な末端ブロッキング基は、キャップ構造（例として、７−メチルグアノシンキャップ）、反転ヌクレオモノマー、例として、３’−３’または５’−５’末端反転（例としてOrtiagao et al. 1992, Antisense Res. Dev. 2:129参照）、メチルホスホネート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例として非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体(conjugate)）などを含む。３’末端ヌクレオモノマーは修飾糖部分を含むことができる。３’末端ヌクレオモノマーは、任意に、オリゴヌクレオチドの３’−エクソヌクレアーゼ分解を防ぐブロッキング基によって置換されることができる３’−Ｏを含む。例えば３’−ヒドロキシルは３’→３’ヌクレオチド間結合を介してヌクレオチドとエステル結合することができる。例えば、アルコキシラジカルはメトキシ、エトキシまたはイソプロポキシであることができ、好ましくはエトキシである。任意に、３’末端における３’→３’連結ヌクレオチドは、置換連結によって連結されることができる。ヌクレアーゼ分解を低減するため、最も５’側の３’→５’連結は修飾連結、例としてホスホロチオエートまたはＰ−アルキルオキシホスホトリエステル結合、であり得る。好ましくは、２つの最も５’側の３’→５’連結が修飾連結である。任意に、５’末端ヒドロキシ部分はリン含有部分、例としてリン酸、ホスホロチオエート、またはＰ−エトキシリン酸、とエステル結合していることができる。]
[0138] １つの態様において、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、ＲＮＡｉ活性が可能であるが遺伝子標的に関してセンス鎖を非活性な状態にする５’基を含む。好ましくは、かかる５’修飾基はリン酸基またはリン酸基よりも大きな基である。このタイプのオリゴヌクレオチドは、しばしばアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に対応する細胞中の標的遺伝子についての増大した特異性を呈す。これはかかるオリゴヌクレオチド中のセンス鎖が、しばしば非特異的に結合し得る任意のヌクレオチド配列の切断を媒介できなくなり、したがって細胞中の任意の他の遺伝子を不活性化しないであろうからである。したがって、かかるオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞中における遺伝子の発現において観察される減少は、しばしばアンチセンス鎖の直接的または間接的な効果が原因となるであろう。本明細書において用いられる場合の「標的遺伝子についての特異性」という語は、細胞におけるオリゴヌクレオチドの効果がどの程度直接的または間接的に、前記オリゴヌクレオチド中に存在するアンチセンスヌクレオチド配列による標的遺伝子発現の阻害の原因となれるかを意味する。]
[0139] したがって、別の態様によれば、本発明は細胞中における標的遺伝子についてのオリゴヌクレオチドの特異性を増大する方法であって、該オリゴヌクレオチドがセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の両方が、前記細胞中に存在した場合、対応するヌクレオチド配列が結合することができ、前記方法が、前記センス鎖が、それが非特異的に結合し得る任意のヌクレオチド配列の切断を媒介することを不可能にするために、前記オリゴヌクレオチドと前記細胞とを接触させる前に、前記センス鎖の５’末端ヒドロキシ部分を、リン酸基またはリン酸基より大きな基で修飾するステップを含み、したがって細胞中の任意の他の遺伝子を不活性化しない、前記方法を提供する。]
[0140] 標的遺伝子特異性を増大する、またはオフターゲットサイレンシング効果を低減する別の方法は、ダイサー切断された２１マーのヌクレオチドの５’末端から２番目に対応する位置に２’−修飾（２’−Ｏメチル修飾など）を導入することである。出願人らの発見は、この２’−修飾をダイサー抵抗性ｄｓＲＮＡ中に配置することを可能にし、したがってオフターゲットサイレンシングがより少ないか全くない、より優れたｓｉＲＮＡコンストラクトを設計することができる。]
[0141] １つの態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである１つの核酸分子およびＲＮＡコンストラクトである一つの核酸分子を含むことができる（すなわち、デュプレックスであることができる）。本発明のアンチセンス配列は、ＲＮＡ様およびＤＮＡ様領域を含む「キメラオリゴヌクレオチド」であることができる。]
[0142] 「ＲＮａｓｅＨ活性化領域」という言葉は、オリゴヌクレオチド、例としてキメラオリゴヌクレオチド、の領域を含み、ここで前記オリゴヌクレオチドが結合した標的ＲＮＡ鎖を切断するのにＲＮａｓｅＨを採用することができる。典型的には、ＲＮａｓｅ活性化領域は、（少なくとも約３〜５個の、典型的には約３〜１２個の間の、より典型的には約５〜１２個の間の、およびより好ましくは約５〜１０個の間の連続したヌクレオモノマーの）ＤＮＡまたはＤＮＡ様ヌクレオモノマーの最小限のコアを含む（例として、米国特許第５，８４９，９０２号参照）。好ましくは、ＲＮａｓｅＨ活性化領域は、約９個の連続したデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。]
[0143] 「非活性化領域」という言葉は、ＲＮａｓｅＨをリクルートしないかまたは活性化しない、アンチセンス配列の領域、例としてキメラオリゴヌクレオチド、を含む。好ましくは、非活性化領域はホスホロチオエートＤＮＡを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非活性化領域を含む。１つの態様において、非活性化領域は、ヌクレアーゼに対して安定化されることができるか、または、標的と相補的にし、オリゴヌクレオチドによって結合される標的核酸分子と水素結合を形成することにより、標的についての特異性を提供することができる。]
[0144] １つの態様において、連続的なポリヌクレオチドの少なくとも一部は置換連結、例としてホスホロチオエート結合、によって連結されている。
ある態様において、ほとんどまたは全てのセンス鎖ヌクレオチド（２’−修飾であるかまたはない）は、ホスホロチオエート結合によって連結されている。かかるコンストラクトは、その血清タンパク質との高い親和性に起因して、改善された薬物動態を有する傾向にある。センス鎖におけるホスホチオエート結合は一般的に、一旦ガイド鎖がＲＩＳＣに取り込まれれば、ガイド鎖活性を妨げない]
[0145] 本発明のアンチセンス配列は、「モルホリノオリゴヌクレオチド」を含んでよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり、ＲＮａｓｅＨ非依存性メカニズムによって機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの各４つの遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン／ウラシル）は６員モルホリン環と連結している。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例として非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合により、４つの異なるサブユニットタイプを結びつけることにより作られる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する完全な抵抗性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）、予測可能なターゲティング（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）、細胞中での信頼できる活性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）、すばらしい配列特異性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 7:151）、最小限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）、および単純な浸透圧性またはスクレイプ送達（osmotic or scrape delivery）（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）を含む多くの利点を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドはまた、高用量におけるその非毒性の点でも好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製についての議論は、Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187に見出すことができる。]
[0146] ＩＩＩ．合成
本発明のオリゴヌクレオチドを、当該技術分野において知られた任意の方法、例として酵素合成および／または化学合成の使用、によって合成することができる。本オリゴヌクレオチドを、in vitroで（例として、酵素合成および化学合成の使用）またはin vivoで（当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術の使用）合成することができる。]
[0147] 好ましい態様において、修飾ポリヌクレオチドについて、化学合成を用いる。直鎖オリゴヌクレオチドの化学合成は、当該技術分野において周知であり、溶液または固相技術によって達成することができる。好ましくは、合成は固相法による。オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト、亜リン酸トリエステル、Ｈ−ホスホネート、およびホスホトリエステル法を含む任意のいくつかの異なる合成手順によって、典型的には自動合成法によって作ることができる。]
[0148] オリゴヌクレオチド合成プロトコルは当該技術分野において周知であり、例として米国特許第５，８３０，６５３号、ＷＯ９８／１３５２６、Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soc. 106:6077、Stec et al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908、Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263、LaPlanche et al 1986. Nucl. Acid. Res. 1986. 14:9081、Fasman G. D., 1989. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989.CRCPress, Boca Raton, FIa.、Lamone. 1993. Biochem. Soc. Trans. 21 : 1、米国特許第５，０１３，８３０号、米国特許第５，２１４，１３５号、米国特許第５，５２５，７１９号、Kawasaki et al. 1993. J. Med. Chem. 36:831、ＷＯ９２／０３５６８、米国特許第５，２７６，０１９号および米国特許第５，２６４，４２３号に見出すことができる。]
[0149] 選択される合成方法は、所望のオリゴヌクレオチドの長さに依存し得、かかる選択は通常の当業者の能力の範囲内である。例えば、ホスホロアミダイトおよび亜リン酸トリエステル法は１７５またはそれ以上のヌクレオチドを産生することができ、一方Ｈ−ホスホネート法は１００未満のオリゴヌクレオチドについてよく動作する。修飾塩基がオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、および特に修飾ホスホジエステル結合が用いられる場合、合成手順は既知の手順に従って必要なように改変される。これに関し、Uhlmann et al. (1990, Chemical Reviews 90: 543-584)が、修飾塩基および修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの作製の参照および手順のアウトラインを提供する。オリゴヌクレオチドの作製の他の代表的な方法はSonveaux. 1994. "Protecting Groups in oligonucleotide Synthesis";Agrawal. Methodsin Molecular Biology 26:1に教示されている。代表的な合成方法はまた、"Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach" (Gait, M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984)に教示されている。さらに、定義された配列の直鎖オリゴヌクレオチド、修飾ヌクレオチドを有するいくつかの配列を含む、はいくつかの商業的供給源から容易に入手できる。]
[0150] オリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または任意の多くのクロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィーおよび高圧液体クロマトグラフィーを含む、によって精製されてよい。ヌクレオチド配列、特に非修飾ヌクレオチド配列、を確認するためオリゴヌクレオチドを任意の既知の手順、マクサムおよびギルバートシークエンシング、サンガーシークエンシング、キャピラリー電気泳動シークエンシング、ワンダリングスポットシークエンシング手順を含む、によってまたはハイボンドペーパーに結合したオリゴヌクレオチドの選択的化学分解によって、ＤＮＡシークエンシングにかけてもよい。短鎖オリゴヌクレオチドの配列はまた、レーザー分解質量分析または高速原子衝突によっても分析することができる（McNeal, et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:976; Viari, et al., 1987, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 14:83; Grotjahn et al., 1982, Nuc. Acid Res. 10:4671）。シークエンシング法はＲＮＡオリゴヌクレオチドにも利用可能である。]
[0151] 合成されたオリゴヌクレオチドの質は、例としてBergot and Egan. 1992. J. Chrom. 599:35を用いた、キャピラリー電気泳動および変性強アニオンＨＰＬＣ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）によってオリゴヌクレオチドを試験することによって検証することができる。]
[0152] 他の代表的な合成技術は当該技術分野に周知である（例として、Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual第２版 (1989); DNA Cloning, Volumes IおよびII (DN Glover Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M J Gait Ed, 1984; Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);またはMethods in Enzymologyシリーズ(Academic Press, Inc.)参照)。]
[0153] ある態様において、主題のＲＮＡｉコンストラクトまたは少なくともその一部分は主題のコンストラクトをコードする発現ベクターから転写される。任意の当該技術分野で認識されたベクターをこの目的に用いてよい。転写されたＲＮＡｉコンストラクトは、所望の修飾（非修飾のセンス鎖と修飾センス鎖とを置き換えるなど）がなされる前に単離および精製されてよい。]
[0154] ＩＶ．送達／担体
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物は、１または２以上の細胞または細胞溶解物に接触され（すなわち、接触に至らされる、また本明細書において投与されるまたは送達されるともいわれる）、および取り込まれる。「細胞」という語は、原核および真核細胞を含み、好ましくは脊椎動物細胞であり、およびより好ましくは哺乳類細胞である。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、ヒト細胞と接触される。]
[0155] 本発明のオリゴヌクレオチド組成物in vitroで、例として試験管または培養皿内で、（および対象に導入されてもされなくてもよく）、またはin vivoで、例として哺乳類対象などの対象内で、細胞と接触させることができる。オリゴヌクレオチドはエンドサイトーシスによって低速で細胞に取り込まれるが、エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは一般的に隔離され、例として標的核酸分子へのハイブリダイゼーションには利用できない。１つの態様において、細胞への取り込みは、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿によって促進することができる。しかしながら、これらの手順は、in vitroまたはex vivoの態様においてのみ有用であり、便利ではなく、およびいくつかの場合において細胞毒性を伴う。]
[0156] 別の態様において、オリゴヌクレオチドの細胞内への送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロールまたはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な当該技術分野に認識された方法またはトランスフェクション、例として当該技術分野において既知の、カチオン性、アニオン性または中性脂質組成物またはリポソームを用いた方法によって増強され得る（例として、WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; U.S. Pat. No. 4,897,355; Bergan et al. 1993. Nucleic AcidsResearch. 21 :3567参照）。オリゴヌクレオチドの増強された送達はまた、ベクター（例として、Shi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan. 19:9; Reichhart J M et al. Genesis. 2002. 34( 1 -2): 1604, Yu et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:6047; Sui et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5515参照）、ウィルス、ポリアミンまたはポリリジン、プロタミンまたはＮｉ，Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミンなどのポリカチオン抱合体を用いた化合物の使用によって媒介することができる（例として、Bartzatt, R. et al.1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 1 1 :133; Wagner E. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4255参照）。]
[0157] オリゴヌクレオチドの取り込みについての最適なプロトコルは多数の因子に依存し、最も重要なものは用いられた細胞のタイプであろう。取り込みに重要な他の因子は、これに限定するものではないが、オリゴヌクレオチドの性質および濃度、細胞の集密度、細胞培養のタイプ（例として、懸濁培養または平板培養）および細胞が成育している培地のタイプを含む。]
[0158] 抱合剤
抱合剤はオリゴヌクレオチドと共有的に結合している。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、抱合体と結合して細胞取り込みを促進するために、誘導体化するか、または化学的に修飾してもよい。例えば、コレステロール部分とオリゴヌクレオチドとの共有結合は、細胞取り込みを５〜１０倍改善することができ、そしてその結果ＤＮＡ結合を約１０倍改善することができる（Boutorin et al., 1989, FEBSLetters 254:129-132）。オクチル、ドデシルおよびオクタデシル残基の抱合は、非修飾のオリゴヌクレオチドと比較して、細胞取り込みを３、４および１０倍増強する（Valassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。同様に、ポリ−Ｌ−リジンによるオリゴヌクレオチドの誘導体化は、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを助けることができる（Schell, 1974, Biochem. Biophys. Acta 340:323,およびLemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:648）。]
[0159] あるタンパク質担体もまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することができ、例えば血清アルブミン、核内へ移行するシグナルを保有する核タンパク質、および細胞膜透過可能なウィルス性または細菌性タンパク質を含む。ゆえにタンパク質担体は、オリゴヌクレオチドと会合したまたは連結した場合に有用である。したがって本発明は、炭化水素および非極性基、コレステロール、長鎖アルコール（すなわちヘキサノール）、ポリ−Ｌ−リジンおよびタンパク質、ならびにフェニルまたはナフチル基、キノリン、アントラセン、またはフェナントラセン基、脂肪酸、脂肪族アルコールおよびセスキテルペン、ジテルペンおよびステロイド類などの、類似の有用な効果を有する他のアリールまたはステロイド基およびポリカチオン、を含むオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することができる基での誘導体化を提供する。抱合体を用いることの主要な利点は、オリゴヌクレオチドのより多くの細胞内蓄積を導く、最初の膜相互作用を増大することである。]
[0160] 他の抱合剤は、ＲＮＡｉコンストラクトを脂肪組織−ビタミンが貯蔵されている主要な場所−に特異的に送達するために用いられ得る脂溶性ビタミンなどの様々なビタミンを含む。これらのビタミンベース抱合剤は、糖尿病／肥満症などのある代謝性障害標的を標的とするのに特に有用である。ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋなど脂溶性ビタミンについて、ビタミンＫが、上限摂取レベルが知られていないため（高い用量は、赤血球の溶解およびおそらく肝臓病に導くものであっても）、いくつかの態様において好ましい。これに対し、ビタミンＡおよびＤは、より定義された毒性および確立された上限摂取レベルを有する。]
[0161] ある態様において、ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、主題のＲＮＡｉコンストラクトに抱合され、その膜粘性を増大し、かつ／またはクリアランスを遅くし、一般的な取り込みを改善する（以下）。]
[0162] 本発明のコンストラクトと一緒に用いられ得るある抱合剤は、Ｔａｔペプチド、WO04048545A2およびUS20040204377A1の配列番号１２の配列、ホメオボックス（ｈｏｘ）ペプチドと実質的に類似の配列、ＭＴＳ、ＶＰ２２、ＭＰＧ、少なくとも１つのデンドリマー（ＰＡＭＡＭなど）などの、WO04048545A2およびUS20040204377A1（全てその全体が本明細書に組込まれる）に記載されている。]
[0163] 本発明のコンストラクトと一緒に用いられ得る他の抱合剤は、様々なナノトランスポーターおよび核酸分子（主題のｄｓＲＮＡコンストラクトなど）および／または他の薬剤のin vivoおよびin vitroでの送達に用いるための送達複合体を記載したWO07089607A2（本明細書に組込まれる）に記載されているものを含む。かかる送達複合体を用いて、主題のｄｓＲＮＡは、少なくとも１の機能性表面基（functional surface group）と抱合されたコアを有するナノトランスポーターと抱合したりまたは会合したりしながら、送達され得る。コアは、デンドリマー（例としてポリリジンデンドリマー）などのナノ粒子であってよい。コアはまた、単層ナノチューブまたは多層ナノチューブなどのナノチューブであってもよい。機能性表面基は、少なくとも1つの脂質、細胞タイプ特異的ターゲティング部分、蛍光分子および電荷コントロール分子である。例えば、ターゲティング部分は組織選択的ペプチドであってもよい。脂質はオレオイル脂質またはその誘導体であってよい。代表的なナノトランスポーターは、ＮＯＰ−７またはＨＢＯＬＤを含む。]
[0164] 封入剤
封入剤は、オリゴヌクレオチドをベシクル内に閉じ込める。本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドは担体またはビヒクル、例としてリポソームまたはミセルであるが、当業者に十分理解されるように他の担体も用いることができる、と会合していてよい。リポソームは、生体膜と類似の構造を有する、脂質二重膜で作られるベシクルである。かかる担体は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みまたはターゲティングを促進するために用いられ、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態学的または毒物学的特性を改善するために用いられる。]
[0165] 例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソームに封入されて、活性成分が分散しているかまたは脂質層に付着した水性の同心円層からなる微粒子として様々に存在している医薬組成物として投与されてもよい。溶解性に依存して、オリゴヌクレオチドは水性相および脂質層両方に存在し得、または一般的にリポソーム性懸濁液（liposomic suspension）と言われる状態である。疎水性層は、一般的にだが排他的ではなく、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸などの多かれ少なかれイオン性の界面活性剤、または疎水性の性質である他の材料を含む。リポソームの直径は一般的に約１５ｎｍから約５ミクロンである。]
[0166] 薬物送達ビヒクルとしてのリポソームの利用は、いくつかの利点を提示する。リポソームは細胞間安定性を増大し、取り込み効率を増大し、生物活性を改善する。リポソームは、細胞膜を形成する脂質と類似のあり方で配列される脂質で構成される中空の球状ビヒクルである。それらは水溶性化合物を閉じ込める内在性の水性空間を有し、直径で０．０５から数ミクロンのサイズの範囲である。いくつかの研究が、リポソームが核酸を細胞に送達することができることおよび核酸が依然として生物学的に活性であることを示してきた。例えば、最初は研究ツールとして設計された脂質送達ビヒクル、リポフェクタミンまたはLIPOFECTAMINETM２０００などは、完全な核酸分子を細胞に送達することができる。]
[0167] リポソームを用いることの具体的な利点は、以下を含む：それらは組成物中で非毒性かつ生分解性である；それらは長い循環半減期を示す；そして認識分子はすぐに組織ターゲティングのためにその表面に取り付く。最後に、液体懸濁物または凍結乾燥製品いずれでも費用効果の高い製品であるリポソームベースの医薬品は、許容可能な薬物送達システムとしてのこの技術の実行可能性を実証してきた。]
[0168] 錯化剤(complexing agent)
錯化剤は、本発明のオリゴヌクレオチドと、強いが非共有結合性の引力（例として、静電気的、ファンデルワールス、パイスタッキングなどの相互作用）によって結合する。１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは錯化剤と複合し、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増大する。錯化剤の例は、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質はオリゴヌクレオチドの細胞への送達に使用可能である。]
[0169] 「カチオン性脂質」という語は、極性および非極性ドメインの両方を有し、生理学的ｐＨまたはその近傍において正に帯電する能力があり、核酸などのポリアニオンと結合し、核酸の細胞内への送達を促進する脂質および合成脂質を含む。一般に、カチオン性脂質は、飽和および不飽和のアルキルおよび脂環式エーテルおよびアミン、アミド、またはその誘導体のエステルを含む。カチオン性脂質の直鎖および分枝鎖アルキルおよびアルケニル基は、例として１から約２５の炭素原子を含有する。好ましい直鎖または分枝鎖アルキルまたはアルケン基は６またはそれ以上の炭素原子を有する。脂環式基はコレステロールおよび他のステロイド基を含む。カチオン性脂質は、例としてＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、アセテート、トリフルオロアセテート、スルフェート、ニトライト、およびニトレートを含む様々な対イオン（アニオン）で調製することができる。]
[0170] カチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、星型デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、LIPOFECTAMINETM（例として、LIPOFECTAMINETM２０００）、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン（Gilead Sciences, FosterCity, Calif.）、およびEufectins（JBL, San Luis Obispo, Calif.）を含む。代表的なカチオン性リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、２，３，−ジオレオロキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）から作ることができる。カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）は、例えば、ホスホチオエートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増大することが見出された（Vlassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。オリゴヌクレオチドはまた、例としてポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合することができ、脂質はこの混合物中に含まれていても含まれていなくてもよく、例としてステリル−ポリ（Ｌ−リジン）である。]
[0171] カチオン性脂質は、当該技術分野において、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するために使用されている（例として、米国特許５，８５５，９１０；５，８５１，５４８；５，８３０，４３０；５，７８０，０５３；５，７６７，０９９；Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1参照）。本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するのに使用することができる他の脂質組成物は、請求された方法に関連して使用することができる。これら上記の列挙されたものに加えて、他の脂質組成物がまた当該技術分野において既知であり、例として、米国特許４，２３５，８７１；米国特許４，５０１，７２８；４，８３７，０２８；４，７３７，３２３に教示されるもの、を含む。]
[0172] １つの態様において、脂質組成物はさらに、オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションのための剤、例としてウィルス性タンパク質を含むことができる（Kamata, et al., 1994. Nucl. Acids. Res. 22:536）。別の態様において、オリゴヌクレオチドを、例として米国特許５，７３６，３９２に教示されているように、オリゴヌクレオチド、ペプチド、および脂質を含む組成物の一部として細胞と接触させる。血清抵抗性である改良された脂質もまた開示されている（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:3176）。カチオン性脂質および他の錯化剤は、エンドサイトーシスを介して細胞中に運ばれるオリゴヌクレオチドの数を増大するように作用する。]
[0173] 別の態様において、オリゴヌクレオチドの取り込みの至適化のためにＮ−置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を用いることができる。ペプトイドは、トランスフェクションのためのカチオン性脂質様の化合物を作出するために用いられている（Murphy, et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1517）。ペプトイドは、標準的な方法を用いて合成することができる（例として、Zuckermann, R. N., et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10646; Zuckermann, R. N., et al. 1992. Int. J. Peptide Protein Res. 40:497）。カチオン性脂質およびペプトイド、リプトイド（liptoid）の組み合わせもまた、主題のオリゴヌクレオチドの取り込みの至適化に用いることができる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。リプトイドは、ペプトイドオリゴヌクレオチドを合成し、アミノ末端サブモノマーを脂質に、そのアミノ基を介してカップリングすることによって合成できる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。]
[0174] 正に帯電したアミノ酸が高度に活性なカチオン性脂質の作出に用いることができることは、当該技術分野において既知である（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:3176）。１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、親油性部分に連結した多くのアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはオルニチン残基を含む（例として、米国特許第５，７７７，１５３号参照）。]
[0175] 別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、約１から約４の間の塩基残基を有するペプチドを含む。これらの塩基残基は、例としてアミノ末端、Ｃ末端またはペプチドの内部領域に位置することができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例として、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例としてアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例としてグリシン（非極性と考えられることもあり得る）、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例として、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例として、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸とは別に、ペプチドの大部分または全ての他の残基は非塩基性アミノ酸、例として、リジン、アルギニン、またはヒスチジン以外のアミノ酸、から選択することができる。好ましくは、長い中性側鎖を有する中性アミノ酸が優位に用いられる。]
[0176] １つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、ガンマカルボキシグルタミン酸残基またはγ−Ｇｌａ残基を１または２以上有する天然または合成のポリペプチドを含む。これらのガンマカルボキシグルタミン酸残基は、ポリペプチドがお互いに、および膜表面に結合することを可能にする。言い換えれば、一連のγ−Ｇｌａを有するポリペプチドは、ＲＮＡｉコンストラクトが接触したあらゆる膜に付着するのを助ける一般的な送達様式として用いられ得る。これは、ＲＮＡｉコンストラクトが血流から一掃されるのを少なくとも遅らせ得、および標的をホーミングする機会を増強し得る。]
[0177] ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、天然のタンパク質中に存在し得る（例えばプロトロンビンは１０個のγ−Ｇｌａ残基を有する）。代替的に、これらは生成された、組換え技術で産生された、または化学的に合成されたポリペプチドに、例えばビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを用いたカルボキシル化によって導入することができる。ガンマカルボキシグルタミン酸残基は連続的であっても非連続的であってもよく、ポリペプチド中のかかるガンマカルボキシグルタミン酸残基の総数および所在は、異なるレベルのポリペプチドの「粘着性」を達成するために制御／微調整することができる。]
[0178] １つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触する細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物および脂質を含む混合物、例として上記の脂質または脂質組成物、と約１２時間から約２４時間の間接触する。別の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触する細胞は、オリゴヌクレオチドを含む混合物および脂質を含む混合物、例として上記の脂質または脂質組成物、と約１日から約５日の間接触する。１つの態様において、細胞は脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日から約３０日もの間接触する。別の態様において、脂質を含む混合物と細胞とを少なくとも約５日から約２０日の間接触したままにしておく。別の態様において、脂質を含む混合物と細胞とを少なくとも約７日から約１５日の間接触したままにしておく。]
[0179] 例えば、１つの態様において、オリゴヌクレオチド組成物と細胞とを、本明細書に記載されたような長期のインキュベーション期間のために、サイトフェクチンＣＳまたはＧＳＶ（Glen Reserch; Sterling, Vaから入手可能）、ＧＳ３８１５、ＧＳ２８８８などの脂質の存在下で接触させることができる。]
[0180] １つの態様において、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と細胞との組成物のインキュベーションは、細胞のバイアビリティを低減させない。好ましくは、トランスフェクション期間の後、細胞は実質的に生存能力がある。1つの態様において、トランスフェクション後、細胞は少なくとも約７０％から少なくとも約１００％の間で生存能力がある。別の態様において、細胞は少なくとも約８０％から少なくとも約９５％の間で生存能力がある。さらに別の態様において、細胞は少なくとも約８５％から少なくとも約９０％の間で生存能力がある。]
[0181] １つの態様において、オリゴヌクレオチドを、本明細書において「輸送ペプチド」という、オリゴヌクレオチドを細胞内に輸送するペプチド配列を取り付けることにより修飾する。１つの態様において、組成物は、タンパク質をコードする標的核酸分子と相補的であり、輸送ペプチドを共有結合的に取り付けられているオリゴヌクレオチドを含む。]
[0182] 「輸送ペプチド」という言葉は、オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を促進するアミノ酸配列を含む。それらが連結する部分の細胞内への輸送を促進する代表的なペプチドは当該技術分野において知られており、例としてＨＩＶＴＡＴ転写因子、ラクトフェリン、ヘルペスＶＰ２２タンパク質、およびフィブロブラスト成長因子２（Pooga et al. 1998. Nature biotechnology. 16:857;およびDerossi et al. 1998. Trendsin Cell Biology. 8:84; Elliott and O'Hare. 1997. Cell 88:223）を含む。]
[0183] 既知の技術を用いて、オリゴヌクレオチドに輸送ペプチドを取り付けることができる（例として、Prochiantz, A. 1996. Curr. Opin. Neurobiol. 6:629; Derossi et al. 1998. TrendsCell Biol. 8:84; Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253, Vives et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:16010）。例えば、１つの態様において、活性型チオール基を有しているオリゴヌクレオチドは、そのチオール基を介して輸送タンパク質中に存在するシステインと（例として、アンテナペディアホメオドメイン、例としてDerossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Prochiantz. 1996. Current Opinion in Neurobiol. 6:629; Allinquant et al. 1995. J Cell Biol. 128:919に教示される、の２番目と３番目のへリックスの間のβターンに存在するシステインと）連結する。別の態様において、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基は、輸送タンパク質と、最後のＮ−末端アミノ酸としてカップリングすることができ、ＳＨ基を有しているオリゴヌクレオチドは該ペプチドにカップリングすることができる（Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253）。]
[0184] １つの態様において、連結基をヌクレオモノマーに取り付けることができ、輸送ペプチドをそのリンカーに共有結合的に取り付けることができる。１つの態様において、リンカーは、輸送ペプチドの取付部位として機能することができ、かつヌクレアーゼに対する安定性を提供することができる。好適なリンカーの例は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル鎖、ペプチド、およびヘテロ原子（例として、Ｓ、Ｏ、ＮＨなど）を含む。他の代表的なリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）（例として、Smith et al. Biochem J 1991. 276:417-2参照）などの二官能性の架橋剤を含む。]
[0185] １つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子を細胞内に送達するためのレセプター媒介性エンドサイトーシスメカニズムに利用する分子抱合体として合成される（例として、Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559,およびこれらに参照されている文献参照）。]
[0186] ターゲティング剤
オリゴヌクレオチドの送達はまた、オリゴヌクレオチドを細胞のレセプターにターゲティングすることによっても改善することができる。ターゲティング部分は、オリゴヌクレオチドと抱合することができ、またはオリゴヌクレオチドに連結した担体基（すなわちポリ（Ｌ−リジン）またはリポソーム）に取り付けることができる。この方法は、特異的レセプター媒介性エンドサイトーシスを呈する細胞に良く適している。]
[0187] 例えば、６−ホスホマンノシル化タンパク質とのオリゴヌクレオチド抱合体は、遊離オリゴヌクレオチドよりも、マンノース６−ホスフェート特異的レセプターを発現する細胞によって２０倍もより効果的に内在化される。オリゴヌクレオチドはまた、細胞性レセプターのリガンドと、生分解性リンカーを用いてカップリングされてもよい。別の例において、送達コンストラクトは、ビオチン化オリゴヌクレオチドと強い複合体を形成するマンノシル化ストレプトアビジンである。マンノシル化ストレプトアビジンはビオチン化オリゴヌクレオチドの内在化を２０倍増大させることが見出された（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。]
[0188] 加えて、特異的リガンドは、ポリリジンベース送達システムのポリリジンコンポーネントに抱合され得る。例えば、トランスフェリン−ポリリジン、アデノウィルス−ポリリジン、およびインフルエンザウィルスヘマグルチニンＨＡ−２ Ｎ−末端融合ペプチド−ポリリジン抱合体は、真核細胞におけるレセプター媒介性ＤＮＡ送達を大幅に増強する。肺胞マクロファージ中のポリ（Ｌ−リジン）に抱合されたマンノシル化糖タンパク質は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強するために採用されてきた（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。]
[0189] 悪性細胞は、葉酸およびトランスフェリンなどの必須栄養素の増大した必要性を有するため、これらの栄養素を癌性細胞に対するオリゴヌクレオチドの標的として使うことができる。例えば、葉酸がポリ（Ｌ−リジン）と連結した場合、オリゴヌクレオチド取り込みの増強が前骨髄性白血球（ＨＬ−６０）細胞およびヒトメラノーマ（Ｍ−１４）細胞においてみられた。Ginobbi et al. 1997. Anticancer Res. 17:29。別の例において、マレイル化ウシ血清アルブミンでコートされたリポソーム、葉酸またはプロトポルフィリンＩＸ鉄は、ネズミマクロファージ、ＫＢ細胞、および２．２．１５ヒトヘパトーマ細胞において増大したオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを示した。Liang et al l 999. Pharmazie 54:559-566]
[0190] リポソームは自然に肝臓、脾臓および細網内皮細胞に蓄積する（受動的ターゲティングと呼ばれる）。リポソームと抗体やプロテインＡなどの様々なリガンドをカップリングすることにより、特定の細胞集団を能動的にターゲティングすることができる。例えば、プロテインＡを有するリポソームは、Ｌ細胞上に発現するマウス主要組織適合性複合体Ｈ−２Ｋを標的とするＨ−２Ｋ特異的抗体で前処理してよい（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。]
[0191] 投与
最適なオリゴヌクレオチドの投与または送達は所望の結果および／または処置される対象に依存して変化してよい。本明細書で使用される場合、「投与」は細胞とオリゴヌクレオチドとを接触させることをいい、in vitroまたはin vivoで実行され得る。オリゴヌクレオチドの用量は標的核酸分子から翻訳されるタンパク質の発現、例としてＲＮＡ安定性からの読み出しまたは治療応答から計測されるような、を過度の実験なしに最適に低減するように調整されてよい。]
[0192] 例えば、核酸標的によってコードされるタンパク質の発現を、用量レジメンがそれにしたがって調整される必要があるか無いかを決定するために計測することができる。加えて、細胞内におけるまたは細胞によって産生されるＲＮＡまたはタンパク質レベルの増大または減少は、当該技術分野において認識されている任意の技術を用いて計測することができる。転写が減少しているかどうかを決定することにより、標的ＲＮＡの切断を誘導することにおけるオリゴヌクレオチドの有効性を決定することができる。]

权利要求:

請求項1
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、２’−修飾リボース糖を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
請求項2
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有する、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、該アンチセンス鎖の３’−末端において、（ｉ）非加水分解性のヌクレオチド間結合を有する少なくとも４つの連続した２’−修飾リボース糖（ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の２’−修飾リボース糖、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾リボース糖、または（ｉｉｉ）保護基を含む、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
請求項3
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれにおける１または２以上のヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を有し、該センス鎖が、該センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいてミスマッチヌクレオチドを含む、および（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
請求項4
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、該センス鎖の前記５’−および３’−末端のそれぞれに４つの連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが存在し、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｂ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
請求項5
標的遺伝子の発現を阻害するための、１２〜４９ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトであって、該ｄｓＲＮＡが、（１）５’−末端および３’−末端を有するセンス鎖、ここで、１２および１０の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドをそれぞれ５’−末端および３’−末端に含む、および、（２）前記センス鎖および前記標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする、５’−末端および３’−末端を有するアンチセンス鎖、ここで該アンチセンス鎖が、（ａ）非修飾である、（ｂ）ホスホチオエート結合を有する４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、または（ｃ）５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、を含み、ここで、（ａ）前記ｄｓＲＮＡがダイサーによる切断に抵抗性であり、（ｂ）前記アンチセンス鎖がＲＩＳＣと会合し、および（ｃ）ｄｓＲＮＡが、配列依存的な様式で標的遺伝子の発現を阻害する、前記二本鎖ＲＮＡコンストラクト。
請求項6
アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位における、標的遺伝子のｍＲＮＡの一様な切断を導く、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項7
ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、該センス鎖の３’−末端から１０番目および１１番目のヌクレオチドの間の単一部位において、ＲＩＳＣによって切断可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項8
ｄｓＲＮＡコンストラクトが、平滑末端である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項9
センス鎖の５’−末端の１２ヌクレオチドおよび３’−末端の１０ヌクレオチドが２’−修飾リボース糖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項10
センス鎖の各末端が、一続きの２’−修飾リボース糖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項11
センス鎖の各末端が、４つ一続きの２’−修飾リボース糖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項12
アンチセンス鎖が、非連続的な２’−修飾リボース糖を含み、１０番目および１１番目のアンチセンスヌクレオチドが修飾されていない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡ。
請求項13
アンチセンス鎖が、２’−修飾リボース糖を、２、３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチドごとに含む、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項14
アンチセンス鎖の最も５’−末端側の２’−修飾リボース糖が、２番目のヌクレオチドである、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項15
ｄｓＲＮＡコンストラクトが、１２〜３５ヌクレオチドの長さ、２５〜３０ヌクレオチドの長さ、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドより長い長さ、２５ヌクレオチドより長い長さ、または３１〜４９ヌクレオチドの長さである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項16
センス鎖の各末端が、独立して、４〜１６個の２’−修飾リボース糖および／または非加水分解性ヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項17
センス鎖の各末端が、対称的なまたは非対称的な数の２’−修飾リボース糖を含む、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項18
２’−修飾リボース糖が、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｈ−（デオキシリボヌクレオチド）またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項19
２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項20
２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−アリルヌクレオチドである、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項21
アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、他の修飾ヌクレオチドを含まない、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項22
ｄｓＲＮＡが、２’−修飾を前記の位置に含まない類似のコンストラクトと比較して、増強された標的特異性または減少したオフターゲットサイレンシングを有する、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項23
アンチセンス鎖が、ホスホチオエート結合を有する少なくとも４つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾３’−末端ヌクレオチドを含む、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項24
ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、センス鎖の３’−末端から２番目のヌクレオチドにおいて、ミスマッチヌクレオチドを含む、請求項１、４および５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項25
ｄｓＲＮＡが、同一の配列を有する非修飾のｄｓＲＮＡと比較して、血清および／または脳脊髄液中での改善された安定性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項26
センス鎖の３’−末端における最後から２〜８番目のヌクレオチドが、それらの対応するアンチセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項27
ｄｓＲＮＡが、初代細胞においてインターフェロン応答を誘導しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項28
センス鎖のいずれかの末端および／またはアンチセンス鎖の３’−末端が、保護基によってブロックされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項29
保護基が、反転ヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドである、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項30
反転ヌクレオチドが、反転デオキシヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項31
反転脱塩基部分が、反転デオキシ脱塩基部分を含む、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項32
反転デオキシ脱塩基部分が、３’，３’−連結または５’，５’−連結デオキシ脱塩基部分である、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項33
センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端の交互ヌクレオチドが、２’−修飾リボース糖を含み、各２’−修飾リボース糖が、逆鎖上の非修飾のヌクレオチドと向き合う、請求項１または３に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項34
最初の２’−修飾アンチセンスヌクレオチドが、最も５’−末端のアンチセンスヌクレオチドであるか、またはアンチセンス鎖の５’−末端から２番目のヌクレオチドである、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項35
標的遺伝子が、ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、ＲＩＰ１４０、ＰＣＳＫ９、ＴＮＦα、ＡＰ２（脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質）またはＭＡＰ４Ｋ４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項36
２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、２’−Ｆ修飾である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項37
２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、プリンヌクレオチドであり、任意に２’−Ｆ修飾修飾および／またはホスホロチオエート結合を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項38
２’−修飾リボースヌクレオチドの間のセンス鎖ヌクレオチドが、１または２以上の、各１〜５ヌクレオチドのバルジを形成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項39
各一続きの２’−修飾リボース糖が、末端ヌクレオチド、末端ヌクレオチドから二番目のヌクレオチド、または末端ヌクレオチドから三番目のヌクレオチドから独立して開始される、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項40
アンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドの５０〜１００％が、独立して２’−Ｆ修飾または２’−Ｏ−メチル修飾である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項41
アンチセンス鎖の５’−末端が、リン酸化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項42
標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡコンストラクトであって、該コンストラクトが、センス鎖上の単一ニック以外は請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡと同一である、前記ＲＮＡコンストラクト。
請求項43
ニックが、アンチセンス鎖の５’末端から約１０塩基のヌクレオチドの逆位置を占める、請求項４２に記載のＲＮＡコンストラクト。
請求項44
ニックが、アンチセンス鎖の５’末端から約５〜１５塩基のヌクレオチドの逆位置を占める、請求項４２に記載のＲＮＡコンストラクト。
請求項45
各二本鎖領域のΔＧが、約−１３ｋｃａｌ／モル未満である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載のＲＮＡコンストラクト。
請求項46
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖を発現するベクター。
請求項47
請求項４６に記載のベクターまたは請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
請求項48
細胞が、培養哺乳類細胞である、請求項４７に記載の細胞。
請求項49
細胞が、ヒト細胞である、請求項４７に記載の細胞。
請求項50
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物。
請求項51
哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡコンストラクトとを接触させることを含む、前記方法。
請求項52
哺乳類細胞が、培養されている、請求項５１に記載の方法。
請求項53
哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項５１に記載の方法。
請求項54
哺乳類細胞を、送達試薬の存在下で接触させる、請求項５１に記載の方法。
請求項55
送達試薬が、脂質である、請求項５４に記載の方法。
請求項56
脂質が、カチオン性脂質である、請求項５５に記載の方法。
請求項57
送達試薬が、リポソームである、請求項５４に記載の方法。
請求項58
哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、哺乳類細胞と、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡコンストラクトの鎖の少なくとも１つを発現するベクターとを接触させることを含む、前記方法。
請求項59
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング効果を改善するための方法であって、ｓｉＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンスヌクレオチドを修飾して、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡコンストラクトとすることを含む、前記方法。
請求項60
ｓｉＲＮＡコンストラクトの標的部位へのin vivo送達を評価する方法であって、ｓｉＲＮＡコンストラクトとともにＰＰＩＢを標的とする請求項１〜５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡコンストラクトを共送達し、標的部位におけるＰＰＩＢ機能の阻害をアッセイすることを含み、ここでＰＰＩＢ機能の標的部位における成功裡の阻害が、標的部位へのｓｉＲＮＡコンストラクトのin vivo送達成功の指標となる、前記方法。